مقدار و انواع پروتئین هایی که سلول های ما تولید می کنند، جزئیات مهمی را در مورد سلامتی و نحوه عملکرد بدن به ما می گوید. اما روش‌هایی که ما برای شناسایی و تعیین کمیت پروتئین‌ها داریم، برای این کار ناکافی هستند. نه تنها تنوع پروتئین ها ناشناخته است، بلکه اغلب، اسیدهای آمینه پس از سنتز از طریق تغییرات پس از ترجمه تغییر می کنند.
در سال‌های اخیر، پیشرفت‌های زیادی در خواندن DNA با استفاده از نانوحفره‌ها صورت گرفته است – غشاهای دقیقه‌ای به اندازه‌ای بزرگ که اجازه می‌دهند یک رشته DNA غیرقابل عبور از آن عبور کند، اما به سختی. زیست شناسان با اندازه گیری دقیق ولتاژ یونی نانوحفره در هنگام عبور DNA، توانسته اند به سرعت ترتیب جفت بازها را در توالی شناسایی کنند. در واقع، امسال از نانوحفره‌ها برای تعیین توالی کل ژنوم انسان استفاده شد – چیزی که قبلاً با فناوری‌های دیگر امکان‌پذیر نبود.
در تحقیقات جدید در علوم پایه مجله، محققان دانشگاه صنعتی دلفت در هلند و دانشگاه ایلینویز در Urbana-Champaign (UIUC) در ایالات متحده این موفقیت‌های نانوحفره‌ای DNA را گسترش داده‌اند و اثبات مفهومی ارائه کرده‌اند که روش مشابه برای شناسایی تک پروتئین امکان‌پذیر است. ، مشخص کننده پروتئین هایی با وضوح تک اسید آمینه و حاشیه خطای بسیار کوچک (10^-6 یا 1 در میلیون).
نویسندگان نوشتند: «این پپتید خوان نانوحفره اطلاعات مربوط به توالی اولیه پپتید را ارائه می دهد که ممکن است کاربردهایی در انگشت نگاری پروتئین تک مولکولی و شناسایی انواع پیدا کند.
اسب های کار سلول های ما، پروتئین ها رشته های پپتیدی بلندی هستند که از 20 نوع اسید آمینه مختلف ساخته شده اند. محققان از آنزیمی به نام هل 308 استفاده کردند که می تواند به هیبریدهای DNA-پپتید متصل شود و آنها را به روشی کنترل شده از طریق یک نانوحفره بیولوژیکی به نام MspA (مایکوباکتریوم اسمگماتیس پورین A) بکشاند. آنها هل 308 DNA هلیکاز را انتخاب کردند زیرا می تواند پپتیدها را از طریق منافذ در مراحل قابل مشاهده نیمه نوکلئوتیدی بکشد، که تقریباً با اسیدهای آمینه منفرد مطابقت دارد.
هر مرحله از دروازه باریک از نظر تئوری یک سیگنال جریان منحصر به فرد تولید می کند زیرا اسید آمینه تا حدی جریان الکتریکی را که توسط یون ها از طریق نانوحفره حمل می شود مسدود می کند.
نویسنده اصلی، هنری برینکرهوف، که پیشگام این کار به عنوان دکترای فوق دکتری در آزمایشگاه فیزیکدان سیس دکر بود، این پروتئین را به گردنبندی با مهره هایی با اندازه های مختلف تشبیه کرد. او گفت: “تصور کنید شیر آب را باز کنید و به آرامی گردنبند را به سمت زهکشی که در این مورد نانو منافذ است، حرکت دهید.” “اگر یک مهره بزرگ مانع از زهکشی شود، آبی که از طریق آن می گذرد فقط یک قطره خواهد بود؛ اگر مهره های کوچکتری در گردنبند درست در زهکشی داشته باشید، آب بیشتری می تواند از آن عبور کند.”
محققان با تکنیک خود می توانند مقدار جریان یونی را بسیار دقیق اندازه گیری کنند – اما نه دقیقا، زیرا عبور گام به گام از منافذ نامنظم است. با این حال، با بارگذاری محیط مایع با هلیکاز، محققان می‌توانند تعداد زیادی قرائت مجزا و همپوشانی از یک مولکول دریافت کنند، یا به تعبیر آنها، پروتئین را به عقب برگردانند و توالی اسید آمینه آن را دوباره بخوانند. با انجام این کار، خطاها را از 13 درصد به عملاً صفر کاهش داد.
رویکرد آنها به محققان این امکان را داد که انواع پپتیدهایی را که تنها با یک اسید آمینه با هم تفاوت دارند، متمایز کنند – چیزی که آنها با ایجاد پپتیدهای مصنوعی با تنها یک اسید آمینه تغییر یافته و نشان دادن این سیستم می‌تواند بین آنها تمایز قائل شود، ثابت کردند.
اما برای خواندن هر یک از اسیدهای آمینه، ابتدا باید بدانند هر کدام از آنها چه نوع سیگنالی را تولید می کند که از طریق منافذ عبور می کند. محققان دریافتند برخی از این سیگنال‌ها ممکن است غیرقابل درک باشند.
به عنوان مثال، هنگامی که آمینو اسید تریپتوفان حجیم از طریق انقباض حرکت کرد، جریان یونی ابتدا کاهش یافت و سپس به طور غیرمنتظره نسبت به انواع کوچک و متوسط افزایش یافت.
برای درک منشأ این الگوها، این تیم بر شبیه‌سازی‌های ابررایانه‌ای توسط زیست‌شناس محاسباتی الکسی آکسیمنتیف (UIUC) تکیه کردند که بر روی چند تا از سریع‌ترین ابررایانه‌های موجود در دسترس محققان دانشگاهی در جهان انجام شد: Frontera، در مرکز محاسبات پیشرفته تگزاس. آبی واترز، در مرکز ملی برنامه‌های ابرکامپیوتری؛ و Expanse، در مرکز ابر رایانه سن دیگو.
تیم آکسیمنتیف از روشی به نام شبیه‌سازی دینامیک مولکولی برای بازسازی رفتار نانوحفره، پروتئین‌ها و محیط اطراف آن با وضوح اتمی استفاده کرد. چنین شبیه‌سازی‌هایی نمی‌توانند به طور کامل مقیاس زمانی واقعی فعالیت نانوحفره‌ای را که تا چند ثانیه ادامه می‌یابد، ثبت کنند. اما با ایجاد 40 تا 50 حالت اولیه در موقعیت‌های مختلف و سپس اجرای 70 شبیه‌سازی به صورت موازی، این تیم توانست آماری را برای تأییدهای مختلف پپتیدها استخراج کند. آنها جریان را محاسبه کردند و با آزمایش مقایسه کردند. این کار محاسباتی توسط Jingqian Liu، یک دانشجوی فارغ التحصیل بیوفیزیک در آزمایشگاه Aksimentiev رهبری شد.
شبیه‌سازی‌ها شامل 30000 اتم بود که در مدت زمان 200 تا 500 نانوثانیه برهم‌کنش داشتند و توانستند نتایج تجربی را مطابقت دهند. مهمتر از آن، آنها نشان دادند که چرا آمینو اسیدهای خاص هنگام عبور از نانوحفره، سیگنال‌های ضد شهودی تولید می‌کنند. در مورد نوع تریپتوفان، سیگنال را می توان به اتصال زنجیره جانبی پپتیدی به سطح نانوحفره بالای انقباض ردیابی کرد.
آکسیمنتیف، استاد فیزیک در UIUC، گفت: «برای هر ترکیب خاص، ما می‌توانیم ببینیم چه اتفاقی برای زنجیره جانبی افتاده است، خواه با سطح تعامل داشته باشد یا در داخل منافذ باقی بماند. سپس می‌توانیم مستقیماً ثابت کنیم که اتصال زنجیره جانبی جریان را افزایش می‌دهد.»
شبیه سازی ها هفته ها طول کشید تا در Frontera که در حال حاضر 10 است، ساخته شودهفتم سریع ترین ابر رایانه جهان و قوی ترین در هر دانشگاه. اما آنها با نوع خوشه محاسباتی موجود در اکثر دانشگاه ها سال ها طول می کشند. تحقیق شناسایی تک پروتئین – که رقابت جهانی برای موفقیت برای آن وجود دارد – توسط آنلاین منتشر شد علوم پایه به عنوان “نخستین انتشار” در 4 نوامبر 2021. این تحقیق توسط شورای تحقیقات هلند، مؤسسه ملی بهداشت ایالات متحده، و بنیاد ملی علوم ایالات متحده و دیگران پشتیبانی شد.
آکسیمنتیف گفت: «فرصت‌های فوق‌العاده‌ای برای توسعه تشخیص با خواندن پروتئین فردی با استفاده از این رویکرد نانوحفره‌ای وجود دارد». “محاسبات نقش بزرگی در توسعه این فناوری‌ها ایفا خواهد کرد. شگفت‌انگیز است که با مدل‌های کامپیوتری می‌توانیم آزمایش‌ها را بازتولید کنیم و بگوییم که چه نوع تعاملاتی در مقیاس نانو وجود دارد.”
نه تنها این، مدل‌های رایانه‌ای روش‌های متفاوتی را برای طراحی ارائه می‌کنند و به محققان اجازه می‌دهند نانو منافذ با اندازه‌های مختلف یا با باقی‌مانده‌های استراتژیک قرار داده شده را که می‌توانند سیگنال‌های تقویت‌شده تولید کنند، آزمایش کنند.
کار بیشتری برای انجام خواندن بیش از 20 اسید آمینه و شناسایی اسیدهای آمینه ای که به طور ناهمگن شارژ می شوند مورد نیاز است، اما آکسیمنتیف به این فکر می پردازد که طی سه تا پنج سال ممکن است یک مدل کارآمد ایجاد کند.
دکر گفت: «ما فکر می‌کنیم که رویکرد جدید ما به ما امکان می‌دهد تغییرات پس از ترجمه را تشخیص دهیم، و بنابراین تا حدودی به پروتئین‌هایی که با خود حمل می‌کنیم بتابانیم.»