روش گسترش بافت نسل بعدی تصویربرداری عصبی را بهبود می بخشد —

این ارتقا در “eMAP”، یک نسخه جدید و بهبود یافته از “تجزیه و تحلیل بزرگ‌نمایی پروتئوم” یا MAP، فناوری که در سال 2016 توسط آزمایشگاه دانشیار Kwanghun Chung معرفی شد، پیاده‌سازی شده است. “e” مخفف epitope-preserving است، به این معنی که مکان‌های اتصال برچسب‌های آنتی‌بادی فلورسنت به احتمال بسیار کمتری مسدود می‌شوند. در مقاله اخیر در پیشرفت علمچانگ و همکارانش نشان می‌دهند که با eMAP، بسیاری از پروتئین‌ها در اتصالات عصبی یا «سیناپس‌ها» اکنون می‌توانند تصویربرداری شوند در حالی که قبلاً نمی‌توانستند.

دانشمندان از جمله جوها پارک، نویسندگان اصلی گزارش می‌دهند: “eMAP معماری مولکولی در مقیاس ریز سیناپس‌ها را حفظ می‌کند و می‌تواند تجزیه و تحلیل با توان بالا مجموعه‌های ماکرومولکولی را با سازگاری استثنایی خود با کتابخانه بزرگ آنتی‌بادی‌های موجود در بازار تسهیل کند.” ساریم خان و دای هی یون. آنها با چانگ در آزمایشگاه‌های او کار می‌کنند که شامل مؤسسه یادگیری و حافظه Picower، مؤسسه مهندسی پزشکی و علوم، و بخش‌های مهندسی شیمی و مغز و علوم شناختی MIT (BCS) است.

افشای اپی توپ ها

فن‌آوری‌های انبساط بافت با تزریق یک مش آکریل آمید به بافت‌ها کار می‌کنند تا همه پروتئین‌ها را لنگر بیاندازند تا وقتی مش منبسط شد، همه آنها با آن منبسط شوند اما نسبت به یکدیگر در یک مکان باقی بمانند. این فناوری‌ها معمولاً این اتصال را با پیوندهای شیمیایی فرمالدئید تثبیت‌کننده انجام می‌دهند. پیشرفت کلیدی این تیم با eMAP، پیکربندی مجدد روش برای کنار گذاشتن آن پیوندهای شیمیایی به نفع بافتن مش به قدری ریز و با آکریل آمید بیشتر بود که پروتئین‌ها از نظر فیزیکی با آن درگیر شوند. این امر باعث شد اپی توپ های گرانبها روی پروتئین ها برای پیوند توسط برچسب های آنتی بادی فلورسنت بازتر شوند.

یون گفت: «یکی از اکتشافاتی که ما انجام دادیم این بود که اجزای هیدروژل نیازی به معرفی در مرحله پرفیوژن زمانی که فرمالدئید وجود داشت، همانطور که در تحقق اولیه MAP وجود داشت، برای دستیابی به انبساط بافتی قوی نبود.

پارک در ادامه توضیح داد: «با حذف فرمالدئید قبل از افزودن محلول MAP، می‌توانیم از اتصال متقاطع شیمیایی بین پروتئین‌ها و شبکه هیدروژل جلوگیری کنیم؛ ما می‌توانیم شرایط بهینه‌ای را پیدا کنیم که می‌تواند به طور دائمی مولکول‌های زیستی را لنگر بیاندازد و در عین حال به آنتی‌بادی‌ها اجازه می‌دهد تا در اعماق بافت منتشر شوند. “

در آزمایش آنها دریافتند که در بین پروتئین های سیناپسی، 49 مورد از 51 برچسب آنتی بادی اکنون می توانند به eMAP متصل شوند در حالی که تنها 35 برچسب می توانند با MAP.

دیدن سیناپس ها

برای کشف ارزش علم اعصاب داشتن این قابلیت‌های برچسب‌گذاری جدید در بافت منبسط شده، تیم با دو آزمایشگاه BCS که سیناپس‌های مختلف پستانداران را مورد مطالعه قرار می‌دهند – الی ندیوی، ویلیام آر. (1964) و لیندا آر. و Guoping Feng، James W. (1963) و Patricia T. Poitras Professor.

این همکاری‌ها تصاویری پر جنب و جوش، بدون نیاز به تقویت، از پروتئین‌هایی که قبلاً حذف شده بودند، مانند باسون و پیکولو، یا آن‌هایی که به سختی قبلاً دیده می‌شدند، مانند Homer1، تولید کردند. تصاویر به وضوح نشان می‌دهند که دقیقاً چگونه پروتئین‌ها در سیناپس‌ها چیده شده‌اند، که امکان اندازه‌گیری فاصله نسبی آنها از یکدیگر و همچنین فراوانی نسبی آنها را فراهم می‌کند.

eMAP همچنین امکان تصویربرداری چند مقیاسی از سیناپس‌ها را در امتداد شاخه‌های عصبی کامل یا دندریت‌ها فراهم می‌کند، به این معنی که برای محققان آسان بود که نه تنها داخل هر خانه سیناپس استعاری را ببینند، بلکه به کل همسایگی کل سلول نیز بزرگنمایی کنند. ندیوی گفت که این پیشرفت بزرگی برای محققان است، زیرا مطالعات در مورد چگونگی تغییر سیناپس‌ها در عمق مغز حیوانات زنده از محدوده‌های با وضوح پایین‌تر استفاده می‌کنند که تصاویر آنها معمولاً باید با روش‌های با وضوح بالاتر تأیید شوند. به طور سنتی که با میکروسکوپ های الکترونی انجام می شد.

ندیوی، یکی از اعضای مؤسسه Picower و دپارتمان‌های زیست‌شناسی و BCS در MIT، گفت: «من ترجیح می‌دهم از EM استفاده نکنم، زیرا کار بسیار زیادی دارد و به خوبی با برچسب‌گذاری ترکیب نمی‌شود. روش Kwanghun فرصتی را برای بدست آوردن همان نوع وضوح و همچنین تصویربرداری از اندازه نمونه بسیار بزرگتر در هر سلول ارائه می دهد.

علاوه بر این، این فناوری اجازه می دهد تا چندین دور برچسب گذاری آنتی بادی بر روی یک بافت مشابه انجام شود، بنابراین دانشمندان می توانند پروتئین های زیادی را در همان سیناپس برچسب گذاری کنند. تیم چانگ با کار با آزمایشگاه‌های ندیوی و فنگ، برچسب‌گذاری شش پروتئین مختلف را در سیناپس‌ها در دو گونه پستاندار مختلف نشان دادند و نشان دادند که چگونه همه آنها در ساختارهای دو طرف سیناپس قرار گرفته‌اند.

آزمایشگاه‌های ندیوی و چانگ همچنین نشان دادند که با برچسب‌گذاری اجزای گیرنده‌های انتقال‌دهنده عصبی GABA در سیناپس‌های بازدارنده (به این دلیل که احتمال تولید سیگنال الکتریکی توسط نورون را کاهش می‌دهند)، می‌توانند تفاوت آنها را بررسی کنند. در واقع، آنها دریافتند که کمی بیش از نیمی از سیناپس‌های بازدارنده هر دو جزء را دارند، اما یک چهارم آنها هیچ کدام را نداشتند و برخی فقط یکی یا دیگری را داشتند.

نویسندگان نوشتند: «این یافته‌ها تأیید می‌کند که سیناپس‌های مهارکننده از نظر محتوای مولکولی همگن نیستند و نشان می‌دهند که eMAP ابزار قدرتمندی برای بازجویی کمی از پروتئوم سیناپسی است.

نویسندگان دیگر مقاله عبارتند از Taeyun Kim، Katherine Villa، Jiachen Lee، Qiangge Zhang و Juhyuk Park.

بنیاد JPB، بنیاد فرهنگی NCSOFT و مؤسسه ملی بهداشت بودجه ای را برای این مطالعه فراهم کردند.