مطالعه نشان می‌دهد که مواد مرجع RNA برای استاندارد کردن تست‌های COVID-19 مفید هستند

دانشمندان با استفاده از روش‌های مبتنی بر تکنیک آزمایشگاهی به نام واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)، گردش SARS-CoV-2، ویروسی که باعث COVID-19 می‌شود، ردیابی و نظارت می‌کنند. PCR همچنین به عنوان تست “استاندارد طلایی” برای تشخیص COVID-19 در افراد استفاده می شود، تکه های DNA را با کپی کردن چندین بار آنها از طریق یک سری واکنش های شیمیایی تقویت می کند. تعداد چرخه‌هایی که برای تقویت توالی‌های DNA مورد علاقه نیاز است به طوری که توسط دستگاه PCR، معروف به آستانه چرخه (Ct) قابل تشخیص باشند، چیزی است که محققان و متخصصان پزشکی برای شناسایی ویروس به آن توجه می‌کنند.

با این حال، همه آزمایشگاه‌ها مقادیر Ct یکسانی را دریافت نمی‌کنند (گاهی اوقات مقادیر “Cq” نیز نامیده می‌شود). در تلاش برای مقایسه بیشتر نتایج بین آزمایشگاه‌ها، مؤسسه ملی استانداردها و فناوری (NIST) به یک مطالعه چند سازمانی کمک کرد که به تثبیت این مقادیر Ct به یک نمونه مرجع با مقادیر شناخته شده ویروس پرداخت.

محققان یافته های خود را در مجله منتشر کردند PLOS One.

SARS-CoV-2 یک ویروس RNA است: ماده ژنتیکی آن به جای دو رشته ای مانند DNA تک رشته ای است و حاوی برخی بلوک های ساختمانی مولکولی مختلف، یعنی اوراسیل به جای تیمین است. اما آزمایش PCR فقط با DNA کار می کند و آزمایشگاه ها ابتدا باید RNA را به DNA برای غربالگری COVID-19 تبدیل کنند. برای آزمایش، RNA از نمونه بیمار جدا شده و با سایر مواد، از جمله توالی‌های DNA کوتاه معروف به پرایمر، ترکیب می‌شود تا RNA را به DNA تبدیل کند.

هنگام انجام آزمایش PCR، آزمایشگاه ها اغلب از مقدار Ct برای تشخیص مثبت یا منفی COVID-19 استفاده می کنند. آزمایشگاه‌ها اغلب یک مقدار Ct «قطعی» تعیین می‌کنند که بالاتر از آن تفسیر می‌کنند و اگر ویروس پس از تعداد چرخه‌های مشخصی شناسایی نشد، می‌توانند بیمار را «منفی» اعلام کنند. اما با وجود اینکه آزمایشگاه‌های مختلف می‌توانند ویروس را با استفاده از آزمایش‌های PCR خود به دقت شناسایی کنند، از روش‌ها و ابزارهای آزمایشی خود استفاده می‌کنند که می‌تواند به مقادیر مختلف Ct منجر شود.

می‌توانید آن را مانند پختن کلوچه‌ها در نظر بگیرید—در همان فر، از همان دستور پخت، کوکی‌هایی که به مدت 10 دقیقه می‌پزید احتمالاً نرم‌تر از پختن کوکی‌ها به مدت 15 دقیقه خواهند بود، اما اگر چیزی در دستور غذا متفاوت بود، اگر مگان کلیولند، محقق NIST، یکی از نویسندگان این مطالعه، گفت: برای مثال، اگر از نوع دیگری از ورقه پخت استفاده می‌کردید، دمای فر یکسان نبود، ممکن است آنقدرها قابل مقایسه نباشد.

بنابراین، برای این مطالعه، یک تیم تحقیقاتی چند سازمانی شروع به بررسی مقدار Ct در آزمایشگاه‌های مختلف کردند که آزمایش‌های PCR را روی همان نمونه‌های مرجع حاوی مقادیر شناخته شده ویروس SARS-CoV-2 انجام دادند. دو ماده مرجع با غلظت‌های دقیق اندازه‌گیری‌شده RNA SARS-CoV-2 توسط گروهی از سازمان‌ها و مؤسسات به رهبری INSTAND، یک انجمن علمی بین‌رشته‌ای در آلمان که تضمین کیفیت را در آزمایشگاه‌های پزشکی ترویج می‌کند، توسعه یافت. RM 1 دارای بار ویروسی تخمینی 10 میلیون (10⁷) کپی در هر میلی لیتر، و RM 2 بار ویروسی تخمینی یک میلیون (10) داشت⁶ ) کپی در میلی لیتر.

برای اطمینان از دقیق بودن این مقادیر، سه مؤسسه ملی اندازه‌گیری – آزمایشگاه ملی اندازه‌گیری شیمیایی و زیستی بریتانیا (LGC)، Physikalisch-Technische Bundesanstalt (PTB، در آلمان) و NIST- مواد مرجع را با استفاده از PCR دیجیتال اندازه‌گیری و اعتبارسنجی کردند. دیجیتال PCR همان مراحل PCR سنتی را دنبال می کند اما نسخه پیشرفته تری است. در PCR دیجیتال، نمونه به هزاران قطره ریز تقسیم می شود. همچنین ترکیبی به آن اضافه می‌شود تا وقتی DNA هدف شناسایی شد، درخشندگی ایجاد می‌کند و به محققان این امکان را می‌دهد تا با حضور مولکول‌های فلورسنت، تأیید کنند که آیا نمونه برای کروناویروس مثبت است یا خیر.

مواد مرجع در مجموع به 305 آزمایشگاه در آلمان ارسال شد که 1109 مجموعه داده را برای تجزیه و تحلیل به دست آوردند. مقادیر Ct بین آزمایشگاه ها بسته به سیستم آزمایش یا تجهیزات PCR مورد استفاده و توالی DNA هدف ویروس متفاوت است. به عنوان مثال، سنجش PCR با هدف شناسایی یک ژن کلیدی (ژن “N”) در ویروس کووید-19 دارای محدوده ای از مقادیر Ct بین 17.6 و 26.9 برای RM 1 بود، در حالی که برای RM 2 این محدوده بین 20.7 و 30.1 بود. به گفته کلیولند، محدوده بین دو RM با هم همپوشانی دارند (20.7 تا 26.9) حتی اگر غلظت های بار ویروسی متفاوتی داشته باشند، که نشان می دهد نمی توان غلظت دقیق را تنها از روی مقادیر Ct تشخیص داد.

تفاوت در مقادیر Ct در بین آزمایشگاه‌ها سودمندی مواد مرجع را به عنوان ابزاری برای کمک به آزمایشگاه‌ها در مقایسه و استانداردسازی نتایج خود نشان داد.

برخی قبلاً مقدار Ct را به عنوان راهی برای اندازه گیری بار ویروسی، مقدار ویروس در بدن یک فرد می دانستند. اما تغییر در مقادیر Ct در آزمایشگاه ها نشان می دهد که این دو متغیر صرفاً با یکدیگر همبستگی دارند. به عنوان مثال، اگر فردی دارای بار ویروسی بالاتری باشد، مقدار Ct او پایین خواهد بود زیرا چرخه های کمتری برای تقویت ماده ژنتیکی ویروس طول می کشد.

“مقدار Ct پایین تر به معنای DNA بیشتر با ویروس کرونا است که در نمونه شروع می شود. این مقدار با بار ویروسی مرتبط است. اما Ct بسته به ماده استخراج یا روش مورد استفاده می تواند متفاوت باشد. همه این موارد می تواند بر روی نقطه ای که DNA قرار دارد تاثیر بگذارد. کلیولند گفت.

به گفته NIST، با این حال، با استفاده از مواد مرجع مناسب، مقادیر Ct به طور بالقوه می تواند به مقدار غلظت واقعی ویروس در کپی در هر میکرولیتر تبدیل شود، که یکی از راه های تعیین کمیت بار ویروسی است، اگرچه این موضوع تمرکز مطالعه نبود. محقق و نویسنده همکار پیتر والون.

برخی همچنین استفاده از مقادیر Ct را برای تعیین میزان عفونی بودن بیمار پیشنهاد کرده اند، روش دیگری که کلیولند نسبت به آن هشدار می دهد. “کسانی در این زمینه هستند که سعی می کنند بگویند، برای مثال، مقدار Ct بالای 30 به این معنی است که یک فرد مبتلا به کووید است، اما برای سرایت عفونت به فرد دیگر کافی نیست. اما شما واقعا نمی دانید که در کدام سمت هستید، کلیولند گفت: مسری است یا نه، با این ارزش.

اگرچه مقادیر Ct به تنهایی میزان بیماری یا آلودگی یک فرد را تعیین نمی کند، درک این مقادیر می تواند به تصمیم گیری در مورد تعیین معیارهایی برای نظارت بر افراد مبتلا به ویروس کرونا کمک کند. و مواد مرجع RNA می توانند این نتایج را قابل اطمینان تر و قابل مقایسه تر کنند.

مردم باید به جای تکیه بر مقادیر Ct، از مواد مرجع با مشخصه‌های خوب همراه با روش‌های آزمایشی خود استفاده کنند. مقادیر Ct به خودی خود به راحتی بین آزمایشگاه‌های آزمایش قابل مقایسه نیست، اما دسترسی محققین به مواد مرجع و درک اهمیت آنها ضروری است. کلیولند گفت مفید است.