نگاهی در مقیاس نانو به عفونت کروناویروس —

WE Moerner، استاد شیمی، و Stanley Qi، استادیار مهندسی زیستی و محقق مؤسسه در استانفورد ChEM-H، از این روش استفاده کرده‌اند که به دانشمندان یک دید در مقیاس نانو به سلول می‌دهد تا دقیقاً کجای سلول را مشخص کنند. ویروس کرونا – مانند پروتئین سنبله و ماده ژنتیکی – در نقاط مختلف پس از عفونت قرار دارند. آنها دریافتند که برخلاف آنچه که میکروسکوپ کانفوکال با وضوح پایین نشان داده است، دستگاه تکثیر ویروس و محصول RNA آن فرآیند به صورت فیزیکی در سلول جدا شده اند که می تواند جزئیات جدیدی را در مورد چرخه حیات ویروسی نشان دهد.

Moerner، استاد هری اس. موشر در دانشکده علوم و علوم انسانی و استاد، با حسن نیت، فیزیک کاربردی، و Qi یک ویروس کرونا به نام HCoV-229E را مطالعه کردند که مانند پسر عموی خود SARS-CoV-2 از یک ویروس تشکیل شده است. پوشش پروتئینی میخچه ای که رشته ای از RNA، ماده ژنتیکی ویروس را احاطه کرده است. این تک رشته RNA ژنومی یا gRNA حاوی دستورالعمل‌هایی برای ساخت تمام پروتئین‌هایی است که ویروس به آن نیاز دارد، از جمله پروتئین‌هایی که کپی‌هایی از gRNA می‌سازند و آن‌هایی که در بسته‌بندی که دور RNA می‌پیچد تا یک ویروس دست‌نخورده جدید بسازند، جمع می‌شوند. .

چی، که همچنین استادیار شیمی و زیست‌شناسی سیستمی است، می‌گوید: «هنگامی که سلول آلوده می‌شود، خود را به یک زامبی تبدیل می‌کند که کاملاً با ذهن کنترل می‌شود تا ویروس بیشتری تولید کند.

دانشمندان درباره اینکه کدام مولکول ها در چه مراحلی از چرخه حیات ویروسی نقش دارند، چیزهای زیادی می دانند. اما دقیقاً جایی که تمام مولکول‌های ویروس در طول این مراحل در سلول قرار دارند تا حد زیادی بی پاسخ مانده است. درک این جزئیات ظریف می‌تواند بینش بیشتری در مورد چگونگی آلوده کردن سلول‌ها توسط ویروس ارائه دهد و به محققان کمک کند آسیب‌پذیری‌ها را پیدا کنند یا درمان‌های بهتری برای عفونت ایجاد کنند.

در این مطالعه که در روش های گزارش سلولی در 28 فوریه، تیم دو شکل مختلف RNA را به صفر رساند: RNA دو رشته‌ای یا dsRNA، که واسطه‌ای در مسیر ساخت نسخه‌های جدید ویروس است، و gRNA، که یک رشته از آن به سلول تزریق می‌شود. ، تکثیر شده و سپس در ویروس های جدید بسته بندی می شود. دانستن اینکه این قطعات دقیقاً در کجای سلول قرار دارند می تواند نه تنها به دانشمندان بگوید که مراحل تکثیر ویروس (dsRNA) و مراحل مونتاژ ویروس (gRNA) در کجا انجام می شوند، بلکه این مراحل چگونه از نظر مکانی هماهنگ می شوند.

کهکشان سلولی

میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال روشی رایج برای دیدن اجسام درون یک سلول با ثبت نور ساطع شده از برچسب‌ها یا برچسب‌های فلورسنت است که تفاوت چندانی با مولکول‌هایی ندارد که باعث ایجاد جوراب‌های “day-glo” می‌شوند. اما میکروسکوپ کانفوکال تنها با ساختارهایی که حدود 250 نانومتر (nm) عرض یا بزرگتر دارند می‌تواند دقیق باشد. ذرات ویروس کرونا بسیار کوچکتر هستند و در حدود 120 نانومتر قطر دارند و پروتئین ها و RNA موجود در آنها حتی کوچکتر هستند. (برای مرجع، یک تار مو حدود 100000 نانومتر ضخامت دارد.)

Moerner می گوید: «هیچ گونه امکان دور زدن تاری اساسی میکروسکوپ کانفوکال وجود ندارد. بسیاری از اجسام مهم سلولی بسیار کوچک هستند؛ برخی 50 نانومتر، برخی 10 نانومتر و برخی حتی کوچکتر.»

میکروسکوپ فلورسانس با وضوح فوق العاده از تصویربرداری تک مولکولی با دقت کنترل شده استفاده می کند تا این اجسام سلولی را در فوکوس واضح تری قرار دهد و به دانشمندان اجازه می دهد اجسامی به اندازه 10 نانومتر را ببینند. دانشمندان با استفاده از این تکنیک‌ها تنها می‌توانند در یک زمان به یک سلول نگاه کنند و آزمایش‌ها به زمان و منابع تخصصی زیادی نیاز دارد. علی‌رغم چالش‌ها، جزئیات بی‌نظیری که دانشمندان می‌توانند با آن سلول را مشاهده کنند، این فرآیند را ارزشمند می‌کند. و این پرش در وضوح چیزی غیرمنتظره را برای Moerner و Qi آشکار کرد.

تیم تحقیقاتی از دو برچسب با رنگ های متفاوت برای مشاهده دو مولکول خود استفاده کردند، سرخابی برای gRNA و سبز برای dsRNA. علاوه بر لکه‌های سبز و سرخابی، تصاویر هم کانونی ابرهای سفید تاری را نشان می‌دهند که نشان می‌دهد dsRNA و gRNA می‌توانند در یک نقطه در سراسر سلول باشند و احتمالاً در نوعی ذره با هم پوشیده شده‌اند. اما با استفاده از تکنیک‌های با وضوح فوق‌العاده، تیم چیز بسیار متفاوتی را دید.

مورنر که در سال 2014 جایزه نوبل شیمی را برای توسعه تکنیک‌های میکروسکوپی که به دانشمندان این منظره‌های دقیق را به سلول می‌دهد، دریافت کرد، می‌گوید: «وقتی برای اولین بار آن تصاویر را دیدم، مانند نگاه کردن به یک کهکشان شگفت‌انگیز بود. تصاویر با وضوح فوق العاده، آسمان تاریکی از خوشه های سرخابی درخشان و ستاره های سبز را نشان دادند – و هیچ یک از آنها هرگز همپوشانی نداشتند. برخلاف آنچه تصاویر هم کانونی اشاره کرده بودند، dsRNA و gRNA هرگز در یک مکان در یک زمان نیستند.

آزمایش‌های جداگانه، که در آن‌ها پروتئین‌های ویروس و سلول میزبان را نیز بررسی کردند، تأیید کردند که dsRNA تکثیرکننده ویروس و محصول RNA آن تکثیر هرگز در داخل سلول شناور نمی‌شوند. نتایج آنها تأیید کرد که تکثیر ویروس در بخشی از سلول به نام شبکه آندوپلاسمی یا ER، همانطور که قبلاً شناخته شده بود، رخ می دهد. سپس gRNA تشکیل شده به داخل سلول می ریزد تا در یک ویروس کاملاً تشکیل شده بسته بندی شود. با این حال، برخلاف آنچه مطالعات قبلی نشان داده است، Moerner و Qi اکنون دریافتند که علاوه بر یافتن در داخل ER، dsRNA تکثیرکننده ویروس در کره‌های بزرگ (تا 450 نانومتر) نیز یافت می‌شود که حاوی هیچ gRNA در سراسر سلول نیستند. . آنها گمان می کنند که این حباب های dsRNA که به طور فعال تکثیر نمی شوند، ممکن است نوعی ذخیره موقت dsRNA باشند در حالی که ویروس های جدید بسته بندی و ارسال می شوند.

بررسی درمان های ضد ویروسی

عفونت ویروسی یک فرآیند پیچیده است، و در حالی که تیم دقیقاً نمی‌داند چه چیزی باعث می‌شود ویروس این ذخایر موقت dsRNA را تولید کند، امیدوارند که وضوح فوق‌العاده نیز بتواند به این سؤالات و سؤالات دیگر در آینده پاسخ دهد. با یادگیری بیشتر در مورد زمان و مکان برخی مراحل عفونت ویروسی، دانشمندان ممکن است قادر به توسعه و ارزیابی درمان باشند.

در این مطالعه، محققان آزمایشگاه‌های Moerner و Qi نیز با یکدیگر متحد شدند تا ببینند پس از درمان با رمدسیویر ضد ویروسی چه اتفاقی می‌افتد. آنها مشاهده کردند که در حالی که سطوح gRNA و dsRNA به طور کلی در سلول کاهش می‌یابد، اندازه حباب‌های dsRNA ثابت باقی می‌ماند که از نظریه ذخیره موقت آنها پشتیبانی می‌کند. این تیم امیدوار است که مطالعات بیشتر با ابزار فوق رزولوشن بتواند به تعیین اینکه آیا سایر ضد ویروس ها ممکن است آن کره ها را هدف قرار دهند یا خیر، کمک کند. چی گفت: «وقتی مردم ابزار ندارند، راهی برای دستیابی به یافته‌های جدید ندارند.

مورنر گفت: «این یک مثال عالی از این است که چگونه تا زمانی که به جستجو نروید نمی‌توانید چیزی را که پیدا خواهید کرد، پیش‌بینی کنید. در مورد بیولوژی این سیستم های پیچیده با ابزارهای نوری مدرن در مقیاس نانو چیزهای زیادی می توان آموخت.

سایر نویسندگان دانشگاه استنفورد عبارتند از: Jiarui Wang، دانشجوی فارغ التحصیل سابق، Mengting Han و Leiping Zeng، دانشجوی فوق دکترا، Anish Roy، و دانش پژوهان فوق دکترای سابق Haifeng Wang و Leonhard Möckl.

Moerner استاد دانشکده علوم انسانی، عضو هیئت علمی دانشگاه Stanford ChEM-H و عضو Bio-X و موسسه علوم اعصاب Wu Tsai است. Qi عضو Bio-X، موسسه تحقیقات سلامت مادر و کودک، موسسه سرطان استانفورد و موسسه علوم اعصاب وو تسای است.

این کار توسط مؤسسه ملی علوم پزشکی عمومی و مؤسسه ملی بهداشت حمایت شد. وانگ یکی از اعضای Mona M. Burgess Stanford Bio-X است.